通俗名稱：scAAV shRNA干擾載體，scAAV shRNA knockdown vector

VB系統(tǒng)名稱：哺乳動(dòng)物shRNA干擾scAAV載體，mammalian shRNA knockdown scAAV vector

我們的scAAV（self-complementary adeno-associated virus，中文名為雙鏈腺相關(guān)病毒或者自我互補(bǔ)腺相關(guān)病毒）shRNA干擾載體系統(tǒng)是一種有效敲低哺乳動(dòng)物蛋白基因表達(dá)水平的工具，可用于體外培養(yǎng)細(xì)胞、動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。

scAAV是基于ssAAV（adeno-associated virus，中文名為腺相關(guān)病毒，簡(jiǎn)稱AAV或者ssAAV）改造而成的一種病毒基因組是自我互補(bǔ)型雙鏈DNA的AAV。由于野生型的AAV的病毒基因組是single-stranded DNA，與scAAV區(qū)分時(shí)，往往寫成ssAAV。ssAAV病毒顆粒感染細(xì)胞后，必須借助宿主細(xì)胞的DNA聚合酶復(fù)制出第二條鏈（second strand synthesis）后才能成為有轉(zhuǎn)錄功能的dsDNA（double-stranded DNA，雙鏈DNA）。除了第二條鏈合成途徑，多個(gè)ssAAV進(jìn)到細(xì)胞后，部分正鏈基因組分子和負(fù)鏈基因組分子（plus- and minus-stranded AAV genomes）也能退火形成dsDNA。當(dāng)AAV載體上的基因組長(zhǎng)度小于野生型AAV基因組長(zhǎng)度的一半，包裝出的病毒顆粒也會(huì)出現(xiàn)含有二聚體形式的基因組（dimeric genome），而不是單聚體基因組（monomeric genome）。這些病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞后，二聚體形式的基因組自行退火形成dsDNA，從而繞過(guò)了第二條鏈合成的這一步限速步驟。為了進(jìn)一步增加病毒二聚體基因組的量，我們將AAV載體的3’ ITR（Inverted terminal repeat）中的trs序列（terminal resolution site）刪除。缺失了trs序列的3’ ITR使AAV載體在病毒包裝時(shí)能復(fù)制出一條中央有一個(gè)突變型ITR而兩端是野生型ITR的，而左半序列與右半序列是反向重復(fù)的病毒基因組分子。感染細(xì)胞后，反向重復(fù)的兩半序列通過(guò)分子內(nèi)堿基配對(duì)，最終這條單鏈DNA能自我折疊形成dsDNA。這樣的載體稱之為scAAV載體。

圖1. ssAAV和scAAV基因組形成路徑

與其他常用病毒相比，腺相關(guān)病毒具有以下特點(diǎn)：

• 低免疫原性（low immunogenicity，AAV在人類和其他靈長(zhǎng)類動(dòng)物中非常普遍）
• 安全（strong safety record，AAV對(duì)人類沒(méi)有致病性）
• 結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單（simple structure，AAV是一層衣殼蛋白包裹著一條4.7 kb長(zhǎng)的單鏈DNA的二十面體顆粒）
• 個(gè)頭?。╯mall size，發(fā)現(xiàn)至今，最小的非包膜病毒）
• 相對(duì)穩(wěn)定（high stability，與慢病毒相比，AAV看起來(lái)更像一個(gè)巨大的蛋白分子，MW= ~5,200,000，能耐受一定范圍的pH、溫度、鹽濃度等環(huán)境變化）

故腺相關(guān)病毒載體是基因治療的理想工具，已被廣泛用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)。

研究某個(gè)基因功能，往往從獲得基因功能（gain of function）和缺失基因功能（loss of function）兩個(gè)方向設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。雖然近年涌現(xiàn)了CRISPR等新技術(shù)，shRNA干擾技術(shù)依然是基因功能缺失的熱門技術(shù)。與CRISPR基因敲除不同，shRNA特異性打靶mRNA，不會(huì)改變靶細(xì)胞的基因組序列。與CRISPRi基因沉默不同，shRNA能特異性打靶一個(gè)基因的某一條mRNA。shRNA表達(dá)后，被加?成small interfering RNA（siRNA）。這些siRNA與RNA-induced silencing complex（RISC）結(jié)合，找到與siRNA的反向鏈完全互補(bǔ)的mRNA分子，接著剪切mRNA，從而抑制mRNA編碼的蛋白翻譯表達(dá)。

圖2. shRNA打靶機(jī)制

我們的scAAV shRNA干擾載體在兩個(gè)ITR之間含有兩個(gè)基因表達(dá)盒子。上游基因是Pol III啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的shRNA表達(dá)盒子，而下游基因是Pol II啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光標(biāo)記基因表達(dá)盒子。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，Pol II RNA聚合酶一般轉(zhuǎn)錄mRNA序列，而small RNA分子通常都是Pol III RNA聚合酶負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄的。shRNA序列通常只有幾十bp，必須使用轉(zhuǎn)錄small RNA的Pol III啟動(dòng)子，如人U6啟動(dòng)子。下游marker基因則使Pol II啟動(dòng)子，如CMV啟動(dòng)子。AAV包裝時(shí)的ITR序列來(lái)源于AAV2，這是一種常用的AAV載體構(gòu)建方式，不影響血清型。另一方面，決定血清型的衣殼蛋白基因由Rep/Cap包裝質(zhì)粒編碼。

圖3. scAAV shRNA干擾載體結(jié)構(gòu)圖

從載體構(gòu)建到病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的簡(jiǎn)略流程：

1. 將shRNA序列插入骨架載體，構(gòu)建成最終載體后，轉(zhuǎn)化到E. coli進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增。

2. 將轉(zhuǎn)移質(zhì)粒（含有ITR序列的AAV載體）、Rep-cap質(zhì)粒和adenoviral helper質(zhì)粒一并轉(zhuǎn)染至包裝細(xì)胞（例如293T細(xì)胞），這一步通常叫triple trasnfection。在包裝細(xì)胞里，轉(zhuǎn)移載體負(fù)責(zé)病毒基因組DNA的復(fù)制，Rep-cap質(zhì)粒負(fù)責(zé)表達(dá)出Rep功能蛋白和Cap結(jié)構(gòu)蛋白，adenoviral helper質(zhì)粒負(fù)責(zé)表達(dá)出輔助包裝的蛋白。此時(shí)，scAAV shRNA干擾載體上的兩個(gè)ITR之間的序列會(huì)被包裝進(jìn)Cap結(jié)構(gòu)蛋白組成的衣殼里，成為含有病毒基因組DNA的病毒顆粒。

3. 一旦scAAV病毒感染細(xì)胞，病毒DNA會(huì)釋放并轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核。在細(xì)胞核中，AAV dsDNA與宿主RNA聚合酶結(jié)合，轉(zhuǎn)錄出shRNA分子，打靶宿主靶基因的mRNA。

關(guān)于該載體系統(tǒng)的更多信息，請(qǐng)參考以下文獻(xiàn)：

高效：與傳統(tǒng)ssAAV病毒不同，scAAV病毒能避開(kāi)第二條鏈合成這步限速步驟，高效表達(dá)外源基因。

安全性：AAV是至今最安全的工具病毒。無(wú)論ssAAV載體，還是scAAV載體，產(chǎn)生的病毒都是復(fù)制缺陷型的，不會(huì)引起任何人類疾病。

不破壞宿主細(xì)胞DNA：轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞后，AAV在細(xì)胞核保持著游離DNA（episomal DNA）的狀態(tài)。因此，無(wú)論ssAAV載體，還是scAAV載體，產(chǎn)生的病毒都不會(huì)整合進(jìn)細(xì)胞DNA，從而避免插入突變。

相對(duì)長(zhǎng)時(shí)間的外源基因表達(dá)：游離的AAV dsDNA在細(xì)胞核內(nèi)可存數(shù)周，有些甚至數(shù)月。因此，U6啟動(dòng)子持續(xù)表達(dá)shRNA，能長(zhǎng)期敲低目的基因的表達(dá)水平。

不同血清型感染不同組織細(xì)胞：不同血清型的AAV病毒具有不同的組織親和性。當(dāng)AAV載體（無(wú)論ssAAV，還是scAAV）與不同血清型的Rep-cap質(zhì)粒搭配包裝病毒時(shí)，生產(chǎn)出不同血清型的AAV病毒。

有限的貨物裝載能力：理論上，scAAV載體的裝載能力只有ssAAV的一半。因此，scAAV載體上ITR之間只能插入小于2.2 kb的外源序列。而ssAAV載體最長(zhǎng)能裝4.7 kb外源序列。

5' ITR: 5' inverted terminal repeat. In wild type virus, 5' ITR and 3' ITR are essentially identical in sequence. They reside on two ends of the viral genome pointing in opposite directions, where they serve as the origin of viral genome replication.

U6 Promoter: Drives expression of the shRNA. This is the promoter of the human U6 snRNA gene, an RNA polymerase III promoter which efficiently expresses short RNAs.

Sense, Antisense: These sequences are derived from your target sequences and are transcribed to form the stem portion of the “hairpin” structure of the shRNA.

Loop: This optimized sequence is transcribed to form the loop portion of the shRNA “hairpin” structure.

Terminator: Terminates transcription of the shRNA.

CMV promoter: Human cytomegalovirus immediate early enhancer/promoter. It drives the ubiquitous expression of the downstream marker gene.

Marker: A drug selection gene (such as neomycin resistance), a visually detectable gene (such as EGFP), or a dual-reporter gene (such as EGFP/Neo). This allows cells transduced with the vector to be selected and/or visualized.

SV40 late pA: Simian virus 40 late polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

3' ITR-Δtrs: AAV 3' ITR with a deleted terminal resolution site. The presence of the mutated 3’ITR leads to the generation of single-stranded, inverted repeat genomes with a mutated ITR in the middle and a wild type ITR at each end. This facilitates intramolecular base pairing within the mutant ITR extending through the genome resulting in the folding of the viral DNA to form a double-stranded molecule.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.